Trois centimes de papier et de ruban adhésif pour le diagnostic des maladies

Un nouvel instrument d'analyse microfluidique pourrait améliorer les services de soins dans les pays en développement.
Par Daniel Gorelick
Rédacteur

Washington - À l'aide de papier et de ruban adhésif, des savants ont mis au point un instrument peu coûteux qui permet d'effectuer des analyses sur les liquides organiques pour déterminer la présence de maladies. Cet outil diagnostique de technicité modeste pourrait devenir extrêmement bénéfique dans le secteur de la santé publique des pays pauvres.

Ces instruments de diagnostic tridimensionnels, composés de papier de microanalyse des liquides organiques (test micropapier - 3D microPAD), sont petits, faciles à transporter et n'ont besoin ni de pompe ni d'électricité pour fonctionner. Ils sont donc bien adaptés aux pays en développement, ont indiqué les chercheurs Andres Martinez, Scott Phillips et George Whitesides, de l'université Harvard, dans l'édition du 16 décembre du journal de l'Académie nationale des Sciences des États-Unis d'Amérique.
M. Whitesides est professeur de chimie ; il a dirigé les recherches sur cet instrument de diagnostic et a fondé une organisation à but non lucratif, baptisée Diagnostics-For-All ou Diagnostic pour tous, pour faire en sorte que cette nouvelle technologie puisse parvenir aux pays en développement.

« En mettant au point un outil de diagnostic peu coûteux, utilisable à grande échelle, et qui puisse servir dans des régions qui n'ont guère d'accès à du matériel de laboratoire complexe, nous espérons avoir un impact réel sur la santé publique », écrit M. Whitesides.

En octobre, les laboratoires Whitesides ont mis au point une centrifugeuse en utilisant un fouet à œufs de deux dollars, des tubes de plastique et du ruban adhésif. Cet instrument peut servir à séparer le plasma du sang, préalable nécessaire à de nombreuses analyses médicales.

Les instruments de microanalyse de liquides organiques

Dans les instruments de microanalyse de liquides organiques, ces derniers sont manipulés dans de très petits espaces, souvent de moins d'un millimètre (soit un millième de mètre) - imaginez de l'eau passant par un tube microscopique. De tels canaux microscopiques peuvent être gravés dans de la (du) silicone, du verre, du plastique, ou, comme le cas présent, dans du papier.

L'instrument expérimental (papier microfluidique - 3D micropad) est un carton de plusieurs centimètres carré, capable de détecter les niveaux de sucre et de protéines dans les urines - symptômes du diabète et de l'insuffisance rénale.

Lorsqu'un échantillon de liquide organique est appliqué sur un coin du papier test, ce liquide glisse dans les microcanaux jusqu'à la zone de détection où ont déjà été appliqués des produits chimiques capables de mesurer les niveaux de sucre ou de protéines. Une fois que les liquides organiques touchent cette zone de détection, une réaction chimique se produit et l'endroit cible sur le papier change de couleur, reflétant la quantité de sucre ou de protéines présente.

Ces tests sont achevés en une trentaine de minutes. La couleur peut être observée et interprétée par du personnel ayant une formation minime.

Les microcanaux peuvent conduire un seul échantillon vers plusieurs zones de détection, permettant au personnel médical d'effectuer des tests multiples des niveaux de sucre, un processus nécessaire à une évaluation précise.
Un second avantage qu'offre le micro papier est le fait qu'il est possible de tester plusieurs échantillons sur le même carton - les microcanaux se chevauchent mais, tels des tuyaux placés les uns près des autres, il n'y a pas de connexions entre eux qui permettent aux liquides de se répandre.

Et à l'encontre d'autres instruments de microanalyse, ces tests fonctionnent sans l'aide de pompes pour propulser les liquides dans les microcanaux.

Des tests médicaux pour le monde en développement
En fabriquant des instruments d'analyse microfluidique à base de papier, l'objectif des chercheurs était de produire des épreuves diagnostiques peu coûteuses en utilisant « une technologie particulièrement appropriée aux besoins des pays en développement », a dit à America.gov Andres Martinez, le doctorant qui a aidé à mettre au point le test micropapier et l'auteur de l'étude sur le sujet.

Selon M. Martinez, le papier possède de nombreux avantages dans les instruments de microanalyse.

Le papier est fin et léger, ce qui facilite le transport de nombreuses trousses d'essais vers les régions reculées. Le papier est également inflammable, permettant l'incinération des tests utilisés comme moyen de prévenir les contaminations par le biais de liquides organiques. Enfin, l'abondance de papier fait qu'il sera un jour possible de fabriquer des instruments de diagnostic de ce type localement.

Dans l'avenir, la technologie de fabrication du papier, telle qu'elle s'applique par exemple dans le secteur de l'imprimerie, pourrait être adaptée à la production d'instruments diagnostiques à grande échelle, a ajouté M. Martinez.

Ce dernier œuvre actuellement pour adapter le micropapier à l'analyse du sang, un liquide plus complexe que l'urine, dans le but de mettre au point un test pour détecter l'insuffisance hépatique. Il s'agit, donc, d'adapter le test pour que pouvoir détecter les niveaux élevés d'enzymes dans le sang, une caractéristique de l'insuffisance hépatique.

Toutefois, il n'est pas possible de tester le sang (entier) tel quel. Il faut d'abord retirer les globules rouges, ne laissant que le plasma. Se fondant sur des travaux (de laboratoire) précédents, M. Martinez envisage d'utiliser un fouet à œufs comme centrifugeuse pour séparer le plasma des autres éléments sanguins, puis de l'appliquer sur un micro papier pour détecter les niveaux d'enzymes hépatiques.

De nombreux médicaments ont des effets secondaires néfastes sur le foie, mais il n'y a pas, actuellement, de moyen rapide, fiable et peu coûteux pour évaluer la fonction hépatique chez les malades sur le terrain, a dit M. Martinez. Il espère qu'il sera possible d'utiliser les tests sur micropapier pour détecter les infections microbiennes et virales dans le sang.
Diagnostics pour tous

Pour produire et distribuer, à grande échelle, les tests micropapier, M. Whitesides et ses collègues ont formé Diagnostics pour tous, une société à but non lucratif. Lancée par Hayat Sindi, une scientifique d'Arabie saoudite en visite aux États-Unis, Diagnostics pour tous a pour but d'offrir à la communauté médicale internationale des moyens de diagnostics à la portée des ressources financières de tous.

Mme Sindi, qui a aidé à fonder cette organisation, a participé à la rédaction du plan d'affaires, lequel a remporté plusieurs prix, notamment les prestigieux Prix de 100.000 dollars du concours d'affaires de l'Institut de technologie du Massachusetts et celui du concours de l'école d'affaires de l'université Harvard.

La société Diagnostics pour tous a battu plus de 230 autres équipes concurrentes, à la fois à but lucratif et non lucratif, pour gagner la compétition de l'Institut de technologie du Massachusetts et le prix de 100.000 dollars, en mai, la première fois qu'une société à but non lucratif remporte cette victoire.
http://www.america.gov/st/health-french/2008/December/20081215154019adkcilerog0.1331446.html

The plots above show the PDF’s of four systems for comparison, where each peak in a PDF corresponds to an interatomic distance in the solid. This data was collected at 60 keV in a matter of minutes, highlighting the excellent quality that can be obtained at I15. It is readily clear that the peaks associated with the aluminosilicate framework, such as that at ~1.7 Å due to the (Si,Al)-O bonds, are essentially the same for all patterns but others change dramatically as a function of cation. This is more readily seen below, comparing the PDF’s of the hydrogen form of zeolite A and a specially prepared sample of the Zn form of A. Work is now underway to build a model for the Zn system, a problem that has not yet been tractable using traditional crystallographic analysis with powder diffraction data.

Making New Materials - Zeolites

In Brief

Zeolites are important nanoporous materials with many applications, including use in laundry detergents, as industrial catalysts and for cleaning up nuclear waste. Zeolites have a cage-like structure which enables them to trap charged particles called cations. Scientists from the University of Birmingham have been using Diamond to investigate new ways of locating cations and nanoparticles within different types of zeolites, this is important in order to understand and improve their use.

In detail

Zeolite A is perhaps the prototypical and most studied synthetic zeolite. There are four commonly accepted sites for cations (see below), but frequently the cations are spread out over severally partially occupied sites and therefore it is difficult to find them. A group led by Dr Joseph Hriljac at the University of Birmingham is exploring the possibility of using the Pair Distribution Function (PDF) to locate the exact positions of cations within the pores of zeolite A.

High energy (60 keV) X-ray scattering data was collected at beam line I15 for a series of zeolites with Na, Zn, Ca and Ag cations, in both hydrated and dehydrated states. Data was also collected for ITQ-29, the pure silicon form with no cations.

Représentation du caractère amphiphile

Antimicrobial peptides as efficient DNA vectors

Des peptides cationiques antibactériens comme vecteurs de transfert de gènesAntimicrobial peptides as efficient DNA vectors
Antoine Kichler

Genethon-Cnrs UMR 8115,

1, rue de l’Internationale,

91000 évry, France.

akich@genethon.fr

Burkhard Bechinger

Faculté de chimie, FRE 2446,

4, rue Blaise Pascal,

67000 Strasbourg, France.

Olivier Danos

Genethon-Cnrs UMR 8115,

1, rue de l’Internationale,

91000 évry, France.

L’idée de base de la thérapie génique, qui est de transférer des acides nucléiques dans des cellules dans un but thérapeutique, s’applique aussi bien à la conception de traitements nouveaux pour des maladies génétiques ou acquises qu’à des approches innovantes de vaccination. Cependant, le prérequis pour une thérapie génique est de disposer d’un transporteur (ou vecteur) capable de transférer de manière efficace le gène thérapeutique dans les cellules cibles. Au cours de la dernière décennie, de nombreux vecteurs, biologiques et synthétiques, ont été développés. Malgré une efficacité plus faible que celle des meilleurs vecteurs viraux, les vecteurs non viraux sont attractifs pour plusieurs raisons, par exemple l’absence de contraintes liées à la taille du gène à transporter, ainsi que la sécurité, la versatilité et la facilité d’une production industrielle.
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Bien que la synthèse de plusieurs centaines de composés ait permis d’identifier de bons outils pour la recherche fondamentale, l’efficacité de transfection de ces vecteurs non viraux est encore trop faible pour des applications à visées thérapeutiques. Le développement de nouvelles molécules reste donc nécessaire. Les vecteurs peptidiques sont parmi les moins explorés, bien qu’ils aient un potentiel élevé. La synthèse peptidique permet en effet d’obtenir des produits bien caractérisés et peut être effectuée à grande échelle. De plus, des peptides variants, voire résistants aux dégradations enzymatiques, sont facilement synthétisables. Jusqu’à récemment, les peptides ont été principalement utilisés comme agents auxiliaires pour d’autres systèmes de vectorisation, en particulier des polymères cationiques tels que la polylysine, auxquels ils peuvent apporter une fonction de ciblage cellulaire, une activité de type membranolytique ou encore un signal de localisation nucléaire [1]. Une stratégie émergente consiste à développer des peptides multifonctionnels, capables de délivrer sans adjuvant de l’ADN dans des cellules. Ainsi, notre groupe a montré que le fragment carboxy-terminal de la petite protéine Viral protein R (Vpr) du VIH-1 possède une activité de transfection comparable à celle d’agents cationiques lipidiques et polymériques [2].
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Un agent transfectant doit remplir un cahier des charges minimal. Tout d’abord, le composé doit pouvoir interagir avec l’ADN de manière à favoriser son entrée dans les cellules. Si, comme c’est le cas pour la grande majorité des vecteurs synthétiques, l’entrée se fait par endocytose, le composé doit pouvoir déstabiliser la membrane endosomale avant que l’ADN ne soit dégradé dans le lysosome. Une fois relargué dans le cytosol, l’ADN peut pénétrer dans le noyau au cours de la division cellulaire, lorsque l’enveloppe nucléaire est disloquée. En tenant compte de ces propriétés minimales requises, nous avons défini les caractéristiques suivantes comme étant essentielles pour nos peptides: (1) une séquence relativement courte (<30acides aminés); (2) une densité de charges positives suffisante pour former un complexe avec l’ADN (qui est une macromolécule polyanionique), mais pas trop forte afin de réduire les possibilités d’activation du système du complément; (3) une séquence conférant des propriétés amphipathiques et perméabilisantes; (4) la présence de résidus histidines qui ont la capacité d’améliorer le relargage de l’ADN des endosomes dans le cytosol via un mécanisme similaire à celui des polyéthylènimines [3]. Or, certains peptides antimicrobiens naturellement présents dans le règne animal, y compris chez l’homme, répondent à ces critères [4]. Pour évaluer leur intérêt en tant que vecteurs de transfert de gènes, nous avons utilisé des peptides antibiotiques modèles, dont un des représentants est LAH4 [5]. Outre la présence à chaque extrémité de 2 lysines qui apportent les charges positives, ce peptide est à la fois amphipathique et capable de déstabiliser des membranes. En utilisant des mutants de LAH4 comportant entre 1 et 5 histidines, nous avons pu montrer que la capacité de transfection est maximale lorsqu’au moins 4 histidines sont présentes [6]. Les activités obtenues sur différentes lignées cellulaires indiquent que l’efficacité de LAH4 est comparable à celle d’agents transfectants commercialisés comme le lipide cationique DOTAP. Un dérivé dans lequel les 4 histidines de LAH4 ont été remplacées par des lysines est environ 1000 fois moins actif que LAH4 pour ce qui est de l’efficacité de transfection, alors qu’il condense bien l’ADN. Cela démontre que la compaction de l’ADN ne suffit pas pour obtenir une transfection efficace, et que les résidus histidines jouent un rôle clédu transfert de gènes. Grâce à la synthèse de différents peptides mutants, nous avons pu mettre en évidence d’autres paramètres cruciaux pour le maintien de l’activité du peptide: (1) le peptide doit pouvoir adopter une conformation α-hélicoïdale; (2) outre leur nombre, la position des histidines dans la séquence est importante; (3) le pH auquel le peptide passe d’une orientation transmembranaire à un alignement parallèle à la membrane doit être proche de 6 (Figure 1).


Figure 1
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Modélisation des premières étapes de transfection.

A. Formation des complexes LAH4/ADN. B. Les particules interagissent par l’intermédiaire de liaisons ioniques avec les charges négatives des protéoglycanes présents à la surface cellulaire. C. Les complexes pénètrent par endocytose. LAH4 adopte majoritairement une orientation transmembranaire. D. L’acidification des endosomes entraîne la protonation des résidus histidines du peptide. Celui-ci s’oriente alors parallèlement à la surface membranaire, la partie hydrophobe pénétrant profondément dans la bicouche. Lorsqu’une concentration critique de peptide est atteinte, la membrane est perméabilisée par un mécanisme sans doute proche de celui de détergents, permettant ainsi le passage de l’ADN dans le cytosol.
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Même associé à l’ADN, LAH4 conserve son activité antibiotique [6]. On peut imaginer que cela soit utile dans le contexte d’un transfert de gène thérapeutique chez les patients, en particulier chez ceux qui, atteints de mucoviscidose, développent des infections bactériennes récurrentes associées à une altération progressive et irréversible des poumons [7].
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Les peptides antimicrobiens sont considérés comme les composants clés des systèmes de défense immunitaire innée (qui constituent la première ligne de défense contre les infections). Plusieurs centaines de peptides ont été caractérisés à ce jour [8], révélant une grande diversité structurale et un large spectre d’activité. La conception de nouveaux vecteurs de transfert de gènes tirera sans doute un grand profit de la formidable variété de peptides cationiques naturels.
Remerciements

Ce travail a été effectué avec le soutien du Cnrs, de l’AFM et de Vaincre la mucoviscidose.
Références
1.

Mahato RI, Monera OD, Smith LC, Rolland A. Peptide-based gene delivery. Curr Opin Mol Ther 1999; 1: 226-43.
2.

Kichler A, Pages JC, Leborgne C, et al. Efficient DNA transfection mediated by the C-terminal domain of human immunodeficiency virus type 1 viral protein R. J Virol 2000; 74: 5424-31.
3.

Midoux P, Monsigny M. Efficient gene transfer by histidylated polylysine/pDNA complexes. Bioconjug Chem 1999; 10: 406-11.
4.

Tossi A, Sandri L, Giangaspero A. Amphipathic, alpha-helical antimicrobial peptides. Biopolymers 2000; 55: 4-30.
5.

Vogt TC, Bechinger B. The interactions of histidine-containing amphipathic helical peptide antibiotics with lipid bilayers. The effects of charges and pH. J Biol Chem 1999; 274: 29115-21.
6.

Kichler A, Leborgne C, Marz J, Danos O, Bechinger B. Histidine-rich amphipathic peptide antibiotics promote efficient delivery of DNA into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: 1564-8.
7.

Travis SM, Singh PK, Welsh MJ. Antimicrobial peptides and proteins in the innate defense of the airway surface. Curr Opin Immunol 2001; 13: 89-95.
8.

www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pagl.htm
Auteurs : Antoine Kichler, Burkhard Bechinger et Olivier Danos
Titre : Des peptides cationiques antibactériens comme vecteurs de transfert de gènes / Antimicrobial peptides as efficient DNA vectors
Revue : M/S : médecine sciences, Volume 19, numéro 11, novembre 2003, p. 1046-1047
URI : http://id.erudit.org/iderudit/007269ar